Eyegone en embrión temprano y ovariolas de Drosophila melanogaster (Objetivos e Hipótesis TFG)

 El mes pasado, os hice la introducción a este trabajo sobre eyegone un gen que se encarga de regular la transcripción de unos genes esenciales en el desarrollo, llamados genes Pax. En el embrión temprano y las ovariolas de esta Drosophila melanogaster, que comentabamos (ir a verlo).

Ahora en este blog, vamos a desarrollar el comienzo y la investigación con la hipótesis y los objetivos que posteriormente veremos el cómo lo haremos con la metodología (materiales y métodos).

Te lo recuerdo un poco con el resumen:

Resumen

En este trabajo, se expone el estudio de eyegone (Eyg), siendo este un gen regulador de la
transcripción. En este proyecto se analizó la distribución de eyegone en los ovarios de D.
melanogaster; así como el estudio de la función de eyegone durante el desarrollo de las ovariolas, de este organismo modelo; y el estudio de la posible interacción de eyegone con otros genes involucrados en el desarrollo del oocito. Utilizándose UAS siRNAs, se realizaron mutantes, para analizar eyegone con respecto a dFmR1, Aub y que ocurre en ausencia del propio Eyg; analizando sus resultados mediante métodos cuantitativos (qRT-PCR), de western blot e inmuno-tinciones. Por tanto, los resultados y la discusión profundizan en la idea de la relación de eyegone con dichos genes. Concluyendo que, eyegone, presenta una interacción con dFmR1 y con Aub.

Palabras clave

Drosophila melanogaster, eyegone (Eyg), Familia Pax, genes hox, embrión temprano, ovariolas, RNAs, siRNAs, Wild-type (Wt), dFmR1, Aubergine (Aub), Orb, Proteina de heterocromatina 1 (HP1), Histona 3 metilada en la lisina 9 (3mH3K9),GFP, TO-PRO3, cDNA.

Objetivos del trabajo basados en hipótesis previas (ver introducción)

Se plantean los siguientes objetivos en la investigación de este proyecto:

• El primer objetivo del proyecto, es el análisis de la distribución de eyegone en los ovarios de D. melanogaster.

• El segundo objetivo del proyecto, es el estudio de la función de eyegone durante el desarrollo de las ovariolas, de D. melanogaster.

• El tercer objetivo del proyecto, es el estudio de la posible interacción de eyegone con otros genes involucrados en el desarrollo del oocito.

Materiales y métodos

Los trabajos y experimentos que se detallarán a continuación, se han llevado a cabo con el organismo modelo Drosophila melanogaster (Gen. Drosophila, Subfam. Drosophilinae, Fam. Drosophilidae, Subord. Brachicera, Ord. Díptera, Clas. Insecta, Filo. Arthropoda, Reino. Animalia), descubierto por T.H. Morgan (si queréis saber más de él dejarmelo en comentarios) (s. XIX- s. XX) como organismo fácil de manipular para los estudios genéticos, por su rápida y alta tasa reproductiva, así como por sus genes conservados a lo largo de la evolución.

1. Preparaciones de inmuno-tinción de ovariolas:

Se seleccionan hembras vírgenes del stock de moscas de Mat Gal 4 (para lo que se realizarán selecciones a primera hora de la mañana y a última hora de la tarde, dejándolas a 17ºC, para que su desarrollo sea lento y permita dichas selecciones). Una vez se tienen suficientes hembras, se van realizando periódicamente cruces con los distintos UAS siRNAs: dFmR1, Aub y Eyegone. Para comprobar donde se están silenciando los genes, como control, se cruzarán las hembras Mat Gal 4 con un UAS de GFP (Green Fluorescence Protein). Una vez realizados los distintos cruzamientos, cada uno de ellos se pondrá a 25ºC para que en un periodo de aproximadamente 10 días, se obtengan las primeras hembras vírgenes de cada tipo de cruce, pudiendo realizar experimentos comparativos entre estos organismos modificados y el grupo control sin modificación, en este caso las moscas wild-type (Wt).

Las hembras seleccionadas se dejan dos días para que los ovarios maduren. Tras este periodo de tiempo, se realizan las disecciones separando el abdomen de la cabeza y tórax, siendo el abdomen donde se alojan las ovariolas, de dónde serán diseccionadas y acumuladas en PBS 1X como medio de solución, que además se mantendrán en hielo, para la preservación adecuada de los ovarios.

Una vez se han diseccionado los ovarios se fijan con paraformaldehído (4%), durante 20 minutos. Posteriormente se realiza otra fijación, con paraformaldehído (4%), 0,1% DOC (deoxicolato sódico), y 0,1% tritón, durante 20 minutos, siendo asegurado que la fijación llegue a todas las partes de la ovariola. Tras esta doble fijación, se bloquean los ovarios en una solución de PBS con 0,3%triton y 1%BSAr durante 30 minutos; tras lo cual se realiza la incubación con los anticuerpos primarios durante la noche a 4ºC, en PBT (PBS, 0,1% tween). Los anticuerpos empleados son: anti-Orb (ratón), anti-Eyegone (cobaya), anti-dFmR1 (ratón) y anti-GFP (ratón), anti-HP1 (ratón) y anti-3mH3K9 (conejo). Al día siguiente, se realizan tres lavados con PBT (0,1% tween) de 15 minutos cada uno a temperatura ambiente. Tras los lavados, se procede a la incubación con los anticuerpos secundarios fluorescentes correspondientes, a temperatura ambiente en oscuridad (a partir de este momento hasta el final), para evitar daños en los anticuerpos (con fluorescencia y por ello, sensibles a la luz).

Posteriormente, se lava tres veces durante 15 minutos con PBT (0,1% tween), incluyendo en uno de los lavados TO-PRO3, para marcar el DNA. Por último, se montan las tinciones en Vectashield (Vector Laboratories Inc.), y se visualiza con microscopia confocal (Leica DM 2000).

2. Preparación de ovarios para PCR y qRT-PCR:

Los experimentos de qRT-PCR se han realizado varias veces, para que puedan ser considerados como fiables, siguiendo el siguiente protocolo:

2.1 Extracción de RNA: la extracción de RNA se realiza con TRIsure (Bioline Laboratories Inc.). En primer lugar, se mezclan las ovariolas con 500 μl de TRIsure, se homogeneiza mediante una pistola pellet, y después añadimos 500 μl alcanzando 1 mL como indica el protocolo; posteriormente se deja reposar 15 minutos a 25ºC. Después, se añaden 200 μl de cloroformo, se agita durante 15 segundos vigorosamente con la mano, y se deja reposar 3 minutos. Una vez hecho eso, se centrifuga a 11200 rpm durante 10 minutos (4ºC), permitiendo que se generen tres fases, de donde la parte superior y de color transparente contendrá el RNA. Tras la extracción del RNA se mezcla con 250 μl de Isopropanol que se deja 10 minutos, y se re-centrifuga a 11200 rpm 10 minutos (4ºC); se elimina el isopropanol dejando el pellet, y se lava con 500 μl de etanol (75%), centrifugando por última vez a 10000 rpm en 10 minutos; el pellet se seca y se trata con DNAasa.

2.2 Tratamiento con DNAasa del RNA: se utiliza el protocolo de la turbo DNAasa (TURBO DNAfree. Invitrogen) siendo necesario añadir Turbo DNAasa buffer (10X), 1 μgr de RNA y 1 microlitro de Turbo DNAasa para el RNA, completado con agua miliQ hasta los 50 microlitros, mezclándolo bien y dejando reposar a 37ªC por 20-30 minutos. Posteriormente se añade la DNAasa inactivation reagent con 0,1 del volumen de RNA, y se mezcla bien. Se incuba 5 minutos a temperatura ambiente mezclándolo ocasionalmente. Por último se centrifuga a 9333 rpm durante un minuto y medio, transfiriendo el sobrenadante o RNA a un nuevo tubo, para medirlo con el fluorómetro y espectrofotómetro de microvolúmenes NanoDrop.

2.3 Síntesis de cDNA: para este proceso, se sigue el protocolo de síntesis de cDNA con la SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen). Posteriormente, cuando el cDNA está listo, se realiza una PCR convencional con primers que amplifican el cDNA de la actina para comprobar que la retrotranscripción ha funcionado. Los primers usados son Act Rv (Actina Reverse) (5´-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3´) y Act Fwd (Actina Forward) (5´-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3´).

2.4 Preparación de qRT-PCR: una vez obtenido el cDNA se emplean 2 microlitros de cada muestra para realizar la qRT-PCR, empleando el kit de NZTYRT (Roche Diagnostics GmbH). Las muestras se cargan en capilares, con primers de Actina, Eyegone y dFmR1, que se centrifugan a 1890 rpm durante cinco minutos, antes de introducirlos en la máquina de qRT-PCR (LightCycler de Roche).

Siendo analizados mediante el modelo de Livak (Livak & Schmittgen, 2001). Siguiendo esta fórmula:

Cuantificación de RNA= 2^ -(ΔC grupo control (Wt) - ΔC grupo mutante)

3. Western blot:

En primer lugar, se preparan las muestras con los distintos ovarios y embriones de mínimo 8 horas, como se detalla a continuación. Las muestras se corren en un gel de acrilamida 10%.

3.1 Preparación de muestras: las muestras se tratan para separar la fracción nuclear de la citoplásmica. Para ello, se emplean 100 μl de lisis buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 10 mM de NaCl, 3 mM de MgCl2; 0,3% Nonident P-40; 2mM Na3V04, 10mM NaF e inhibidores de proteasa) en los que se lisan los ovarios y embriones. Las muestras se incuban 10 minutos en hielo. Se centrifuga a 2950 rpm durante 5 minutos a 4ºC. Se separa el sobrenadante y se añaden 100 μl de lisis buffer sin NP40, centrifugando nuevamente a 2950 rpm 10 minutos; se quita el sobrenadante se conserva el pellet que tendrá los núcleos. El pellet, se resuspende en 40 μl de buffer 2X. Una vez preparadas las muestras, se cargan en el gel junto con el marcador.

3.2 Preparación y transferencia de proteínas a membrana: la transferencia se lleva a cabo en Tris Glicina con metanol, durante 40 minutos-45 minutos a 100V a 4ºC. Después, la membrana será bloqueada con 5% de BSA en TBST durante 30 minutos, siendo posteriormente lavada dos veces con TBST, y se le añade el primer anticuerpo (anti-Eyg 1:1000) que se deja o/n a 4ºC.

3.3 Tinción de la membrana con anti-Eyg: se deja el anticuerpo primario o/n a 4ºC. Al día siguiente, se realizan lavados con TBST (TBS, 1% tween), para eliminar el anticuerpo primario (3 lavados de 15 minutos cada uno). Tras esto, se realiza una incubación con el anticuerpo secundario de (Guinea pick 680 de Li-Cor Biosciences), dejándose una hora en oscuridad a temperatura ambiente. Tras la incubación se lava tres veces con TBST durante 20 minutos, manteniendo la oscuridad, y se escanea posteriormente en el escáner Odyssey.

En el siguiente blog, os cuento los resultados que se obtuvieron.

Aquí os dejo el artículo final, ya que mi trabajo solo abarco una parte solamente. 

https://www.researchgate.net/publication/322039916_The_Pax_protein_Eyegone_Eyg_interacts_with_the_pi-RNA_component_Aubergine_Aub_and_controls_egg_chamber_development_in_Drosophila

Vuestra divulgadora científica con mis cuentas de Ammu Neuroscience and Biology. Artículo de Ana María Morón Usero.

Podéis leer más en este glosario de biología.

Gracias por leer. Que la ciencia y la fuerza os acompañe.