Localización neuroanatómica de los sistemas catecolaminérgicos y serotoninérgicos de los peces no teleósteos del género Lepisosteus (Superorden Ginglymodi)
Continuamos con las siguientes partes de este trabajo
Hipótesis: Se plantean dos hipótesis, en este proyecto:
(1) Evaluar si la localización neuroanatómica de los sistemas monoaminérgicos en este grupo peculiar de peces es similar o no a la de otros grupos de peces ya estudiados.
(2) Inferir en base a la conservación neuroanatómica de los sistemas monoaminérgicos en los distintos grupos de peces y otros vertebrados, una similitud funcional de estos sistemas de neurotransmisión.
Objetivos: En este trabajo, los objetivos que se plantean teniendo en cuenta los antecedentes mencionados e intentando responder a las hipótesis anteriores son: el estudio de los sistemas catecolaminérgicos y serotoninérgicos mediante una adecuada identificación, localización y distribución de los mismos, en este grupo de peces y su comparación en términos evolutivos con los datos existentes acerca de estos sistemas de neurotransmisión, en otros vertebrados. Para dicho objetivo principal se tienen dos sub-objetivos:
(1) La identificación y localización mediante el uso de técnicas inmunohistoquímicas de los distintos marcadores neuroquímicos (TH, 5-HT) en el SNC de los peces Lepisosteiformes.
(2) La interpretación de los resultados obtenidos y su comparación evolutiva con el resto de grupos de peces y otros vertebrados bajo el paradigma segmental del modelo neuromérico.
Materiales y métodos:
En este apartado se detallarán las técnicas aplicadas en el laboratorio, mediante los cuales se van a identificar y localizar los sistemas monoaminérgicos en L. platyrhincus y L. oculatus.
Preparación de los animales: Para el presente estudio, se utilizaron 6 ejemplares juveniles de L. platyrhincus (longitud total 11-12 cm) y 4 ejemplares de L. oculatus (longitud total 10-11 cm). En todos los casos el sexo de los animales no pudo ser establecido. Los animales fueron adquiridos a través de proveedores comerciales (Pezycia, Madrid, España). Todos los animales se han mantenido en acuarios a 24-28ºC (temperatura ambiente) y en condiciones de luz natural. La investigación original fue realizada de acuerdo a las regulaciones y las leyes establecidas por la Unión Europea (2010/63/UE) y España (Real Decreto 53/2013), tras la aprobación de la Universidad Complutense para llevar a cabo los experimentos descritos a continuación.
Inmunodetección de la enzima tirosina hidroxilasa (TH) y del neurotransmisor serotonina (5-HT): En primer lugar, los animales fueron profundamente anestesiados por inmersión en una solución al 0,1% de tricaína de metanosulfonato (MS222, Sandoz Basel, SW; pH 7.3); siendo posteriormente perfundidos transcardialmente con solución salina fisiológica seguida de 100-150 mL de paraformaldehído frío al 4% en un tampón de fosfato 0,1 M (PB, pH 7.4). El encéfalo, los ojos y la médula espinal fueron extraídos, y mantenidos en el mismo fijador durante 2-3 horas, para su post-fijación. Después, se sumergieron en una solución de 30% de sacarosa en PB durante 6-8 h, a 4ºC. Luego, se hacen bloques en una solución de 20% de gelatina con 30% de sacarosa en PB, y se almacena durante 6 horas en una solución de formaldehído al 3,7% a 4ºC. Los cerebros se cortaron a 40 μm, de modo transversal y sagital utilizando un micrótomo de congelación por deslizamiento (a –20ºC). Las secciones se recogieron y mantuvieron en PB frío. Por último, los tratamientos posteriores con anticuerpos, se pueden subdividir en dos tipos, según la técnica:
1. Inmunohistoquímica: siendo esta técnica usada para obtener en campo claro la actividad de la enzima TH (1.1) y el doble marcaje de TH y NADPH-diaforasa (ND) (1.2), para la identificación y localización neuroanatómica de la TH.
1.1. Inmunohistoquímica de TH: en esta técnica se tratan las secciones cerebrales con dos lavados en PB, para después ser incubados en una solución al 1% de H2O2 en PB durante 15 minutos para reducir la actividad de peroxidasa endógena, y nuevamente se lava tres veces en PB y se procesa por el método de la peroxidasa antiperoxidasa (PAP) (Sternberger, 1979). Esto incluyó una primera incubación de las secciones en uno de los anticuerpos primarios monoclonales utilizados en el estudio: ratón anti-TH (Millipore, diluido 1:1000). La dilución de los anticuerpos fue hecha en PB que contiene 0,5% de Triton X-100 (PBS-T) y 2% de albúmina de suero bovino (BSA), durante 48 horas. Posteriormente, las secciones se lavan tres veces en PB durante 10 minutos y se incuba durante 90 minutos a temperatura ambiente con el antisuero secundario obtenido en cabra anti-ratón (Millipore, diluido 1:100; BA 100). A continuación, los cortes se incuban con PAP anti- ratón (Millipore, diluido 1:500), durante 90 minutos. Estos anticuerpos se diluyeron en PB que contiene 0,5% de Triton X-100 y 2% BSA. Finalmente, las secciones se lavan tres veces durante 10 min cada uno en PB y posteriormente se tiñeron en 0,5 mg/mL y 3-3´-diaminobenzidina (DAB; Vector SK4100) intensificado con níquel, 0,01% de H2O2 en PB durante 3-5 minutos. El conjunto de series transversales se montaron en los portaobjetos con 0,25% de gelatina en 0,1 M Tris-HCl buffer (TB, pH 7.6) y, después de la deshidratación, se cubren con Entellan (Merck, Darmstadt, Alemania).
1.2. Doble marcaje para NADPH-diaforasa y TH: para la inmunodetección de la TH y la detección histoquímica de la actividad enzimática de la NOS (NADPH-diaforasa) siendo el primero visible en marrón y el segundo visible en azul. Se usa el protocolo utilizado de la peroxidasa antiperoxidasa (PAP), como se explicó para la inmunodetección de la TH. Las secciones antes de la inmunodetección con TH se incuban con 1 mM β-NADPH (Sigma), 0,8 mM nitrotetrazolio azul (NBT) (Sigma), y 0,05 % Tritón X-100 en PB a 37°C, en oscuridad, durante 1–2 h. Después, la reacción se para con sucesivos lavados de PB frío. Tras la tinción de ND, se realizó el doble marcaje con TH, como en estudios previos (López et al., 2016). Las secciones de la reacción histoquímica de NADPH-d se incuban ahora en PB con 1% H2O2 durante 15 min para reducir la actividad de la peroxidasa endógena. Se realizan 3 lavados en PB. A continuación, las secciones se incuban con PAP, incluyendo la primera incubación de las secciones con goat anti-TH de ratón (diluido 1:1000; InmunoStar) durante 48–60 h a 4 °C. Posteriormente, las secciones fueron tratadas inmunohistoquímicamente con la técnica de PAP usando cabra anti-ratón (Dakopatts, diluido, 1: 50) en PB durante 1 h a temperatura ambiente. Para concluir se lava 3 veces en PB durante 10 min, y se incuban durante 90 minutos en el complejo ratón PAP (Chemicon; diluido, 1: 500). Los anticuerpos secundarios y el complejo PAP se diluyen en PB con 0,5% Triton X-100 y 2% BSA. Las secciones nuevamente son lavadas 3 veces con PB, y se tiñen con 0,5 mg/mL de DAB (SK4100; Vector) y 0,01% H2O2 en PB durante 3–5 min, produciendo un color marrón como reacción. Por último, las secciones son montadas en portaobjetos y se cubren, para su posterior observación.
2. Doble inmunohistofluorescencia: siendo esta técnica usada para obtener en condiciones de fluorescencia la presencia de la enzima TH (2.1) y la doble detección de TH y 5-HT (2.2).
2.1. Doble inmunohistofluorescencia THm y THr: en el caso de inmunohistofluorescencia, se utilizan anticuerpos secundarios con fluoróforos. Posteriormente los cortes se trataron de la siguiente forma: (1) primera incubación durante 72 horas a 4ºC en una mezcla de anti-TH de ratón (Millipore, diluido 1:1000) y con anti-TH de conejo (Millipore, diluido 1:500). La dilución de los anticuerpos se hizo en tampón PB que contiene 0,5% de Triton X-100 (TB-T). (2) La segunda incubación durante 90 minutos en oscuridad, a temperatura ambiente en una mezcla de antisueros secundarios en PB-T de suero anti-ratón Alexa-488 (fluorescencia verde; diluido 1: 300; Molecular Probes; catálogo referencia: A11012) y anti-conejo Alexa-594 (fluorescencia roja; diluido 1: 300; Molecular Probes; catálogo referencia: A11013). Después de lavar tres veces en PB, las secciones fueron montadas en portaobjetos y se cubren con medio de montaje Vectashield (Vector, Burlingame, CA).
2.2. Doble inmunohistofluorescencia TH y 5-HT: en esta técnica las secciones se trataron para la inmunorreacción dando los siguientes pasos: (1) primera incubación durante 72 horas a 4ºC en una mezcla de anti-TH de ratón (Millipore, diluido 1:1000) y con anti-5-HT de conejo (Millipore, diluido 1: 1500). La dilución de los anticuerpos se hizo en tampón PB que contiene 0,5% de Triton X-100 (PB-T). (2) La segunda incubación durante 90 minutos a la temperatura ambiente en oscuridad, en una mezcla de antisueros secundarios en PB-T de suero anti-ratón Alexa-488 (fluorescencia verde; diluido 1: 300; Molecular Probes; catálogo referencia: A11012) y anti-conejo Alexa-594 (fluorescencia roja; diluido 1: 300; Molecular Probes; catálogo referencia: A11013). Después de lavar tres veces en PB, las secciones fueron montadas en portaobjetos y se cubren con medio de montaje Vectashield (Vector, Burlingame, CA).
Por último, tras los tratamientos 1.1, 1.2, 2.1 y 2.2, las preparaciones son observadas al microscopio óptico (1.1 y 1.2) y al microscopio óptico de fluorescencia (2.1 y 2.2) (Leica BX51) y acoplado a la cámara de fotos (Olympus DP70), y se realizan microfotografías para la identificación y localización de los grupos de TH, TH-ND y TH-5-HT. Además, el microscopio óptico acoplado a una cámara lúcida con las preparaciones 1.1 y 1.2 permiten la realización de esquemas del encéfalo con los marcajes estudiados (ver Resultados).
ANEXO:
Abreviaturas: ac, comisura anterior; aCb, aurícula del cerebelo; Cb, cerebelo; cc, canal central; cCb, cuerpo del cerebelo; DC, zona central del área telencefálica dorsal; Dd, zona dorsal del área telencefálica dorsal; DF, funículo dorsal; dh, asta dorsal; Dl, zona lateral del área telencefálica dorsal; Dld, zona dorsolateral del área telencefálica dorsal; Dm, zona medial del área telencefálica dorsal; Dlv, zona ventrolateral del área telencefálica dorsal; E, epífisis; em, eminencia media; flm, fascículo longitudinal medial; fr, fascículo retroflexo; gc, gris centralis; GCL, capa de células ganglionares de la retina; gl, capa glomerular del bulbo olfatorio; Hb, habénula; Hyp, hipófisis; igl, capa granular interna del bulbo olfativo; III, tercer ventrículo; inf, infundíbulo; INL, capa nuclear interna de la retina; Ip, núcleo interpeduncular; IPL, capa plexiforme interna de la retina; Ipn, neuropilo interpeduncular; Is, zona incerta; IV, cuarto ventrículo; IXm, núcleo motor glosofaríngeo; LDT, área tegmental laterodorsal; LF, funículo lateral; Lih, lóbulo hipotalámico inferior; L.o., Lepisosteus oculatus; L.p., Lepisosteus platyrhincus; lr, receso hipotalámico lateral; M, región hipotalámica mamilar; MC, Células de Mauthner; Med, médula espinal; MCa, axones de las células de Mauthner; mv, ventrículo mesencefálico; nII, nervio óptico; Nsol, núcleo del tracto solitario; nV, nervio trigémino; ob, bulbo olfatorio; oc, quiasma óptico; ONL, capa nuclear externa de la retina OPL, capa plexiforme externa de la retina; ot, tracto óptico; OT, techo óptico; p1-p3, prosómeros; Pa, área hipotalámica paraventricular; pc, comisura posterior; POA, área preóptica; PT, pretecho; PTh, pretálamo; PVO, órgano paraventricular; r0-r8, rombómeros; Rai, núcleo del rafe inferior; Ram, núcleo del rafe medio; Ras, núcleo del rafe superior; Rhom, rombencéfalo; Ri, núcleo reticular inferior; RM área hipotalámica retromamilar; RTu, área hipotalámica retrotuberal; sac, estrato álbum centralis; SC, núcleo supraquiasmático; SCc, nucleo supraquiasmático caudal; sco, órgano subcomisural; sfgs, estrato fibroso y gris superficial del mesencéfalo; sg, capa granular del cerebelo; sgc, sustancia gris compacta; sm, capa molecular del cerebelo; so, estrato óptico del techo mesencefálico; sol, tracto solitario; Spa, área hipotalámica subparaventricular; spv, capa periventricular del tectum mesencefálico; Tegm, área tegmental mesencefálica; Tel, telencéfalo; Th, tálamo; Tl, torus longitudinalis; Tor, torus semicircularis; TP, núcleo del tubérculo posterior; Tu, región hipotalámica tuberal; Vd, parte dorsal del área telencefálica ventral; VF, funículo ventral; vh, asta ventral; VI, núcleo abducens; VIIm, núcleo motor del nervio facial; VIIIa, área octavolateral anterior; VIIIi, área octavolateral intermedia; VL, zona lateral del área telencefálica ventral; Vm, núcleo motor del nervio trigémino; Vp, núcleo posterior del área telencefálica ventral; V, ventrículo; Vv, zona ventral del área telencefálica ventral; Xm, núcleo motor del nervio vago.
Seguiremos el próximo mes con los resultados de este maravilloso trabajo.
Que la ciencia y la fuerza os acompañe.
Ammu
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